BORSA DI STUDIO PER LE MIGLIORI TESI SULLE MALATTIE RARE - I VINCITORI ANNO ACCADEMICO 2020 E 2021

Concorso nazionale per le tre migliori tesi di laurea sulle “malattie rare” Gli abstracts dei vincitori della XI Edizione


Primo premio (2000,00 Euro): Dott.ssa Federica Rossi (Università degli Studi di Milano-Bicocca) con la tesi: “Analisi proteomica di un modello zebrafish di malattia di Fabry: ricerca dei biomarker di nefropatia di Fabry negli zebrafish portatori di mutazione eterozigote".


La malattia di Fabry è una rara patologia genetica ereditaria dovuta alla mutazione del gene GLA che comporta un deficit parziale o totale dell’enzima alfa-galattosidasi A. Tale deficit determina l’accumulo di alcuni sfingolipidi, prevalentemente globotriaosilceramide (Gb3), all’interno dei lisosomi delle cellule di differenti organi causando un progressivo danno funzionale. Uno degli organi maggiormente colpiti è il rene con il conseguente sviluppo di una insufficienza renale progressiva. Lo scopo di questa ricerca è stato quello di sviluppare un modello zebrafish per poter studiare la fisiopatologia del danno renale e identificare nuovi biomarcatori che permettano una diagnosi precoce della nefropatia in corso di malattia di Fabry. Sono state analizzate le alterazioni dell’espressione proteica nel tessuto renale dello zebrafish portatore di una mutazione in eterozigosi del gene GLA. Utilizzando uno strumento di editing genetico, CRISPR/Cas9, è stato generato uno zebrafish knock-out per il gene GLA. Successivamente, è stato analizzato il pattern di espressione proteica nel tessuto renale dello zebrafish portatore della mutazione in eterozigosi e, successivamente, confrontato con quello dello zebrafish wild-type.

Nello zebrafish mutato l’analisi proteomica delle proteine tissutali ha mostrato una down-regolazione di proteine legate alla funzione lisosomiale, in particolare quelle coinvolte nello sorting endosomiale (WASHC5, VPS29, CHMP4B e WDR91), nell'acidificazione dei compartimenti intracellulari (ATP6V1A), nella crescita cellulare e nell'autofagia (LAMTOR2). Proteine con la stessa funzione sono state identificate nel tessuto renale umano.

I risultati preliminari di questo studio mostrano la presenza di alterazioni proteiche legate alla funzione lisosomiale, indicando un probabile effetto fisiopatologico della mutazione GLA sul rene dello zebrafish. Questi risultati pongono le basi per un potenziale utilizzo dello zebrafish come modello per lo studio della nefropatia in corso di malattia di Fabry. Questo potrebbe essere il punto di partenza per comprendere meglio la fisiopatologia del danno renale e scoprire nuovi biomarcatori che permetteranno una diagnosi precoce di malattia e facilitino lo sviluppo di una terapia mirata per il danno renale e, dunque, per la malattia di Fabry.


Secondo premio (1000,00 Euro): Dr. Simone Amistadi (Università degli Studi di Trento) con la tesi: “EDITING GENOMICO DI PRECISIONE PER CORREGGERE MUTAZIONI CHE CAUSANO FIBROSI CISTICA”


La fibrosi cistica è una malattia genetica rara causata da diverse mutazioni nel gene CFTR (regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica). Le mutazioni 2789+5G>A, 1717-1G>A e 3120+1G>A sono tra i difetti più frequenti che portano ad uno splicing aberrante del gene CFTR e causano la produzione di una proteina non funzionale. In questa tesi abbiamo applicato le recenti tecnologie di editing genomico come i CRISPR base editors e prime editor per correggere precisamente queste mutazioni puntiformi e ripristinare il corretto splicing del gene CFTR. Abbiamo inizialmente valutato l’efficienza di questi metodi in modelli cellulari semplificati capaci di riprodurre il difetto genetico. In particolare, per una mutazione siamo riusciti ad identificare delle condizioni che permettono di avere una modifica precisa ed efficiente in grado di correggere la mutazione e ripristinare il corretto splicing del gene CFTR. Per confermare e validare i risultati abbiamo applicato questa strategia di editing genomico anche in cellule derivate da paziente affetto da fibrosi cistica e siamo riusciti a misurare la ripristinata funzionalità della proteina a seguito della correzione della mutazione.

Questo lavoro di tesi dimostra come i metodi di editing genomico basati sul sistema CRISPR/Cas siano sistemi efficienti per correggere mutazioni che causano la fibrosi cistica. Pone inoltre le basi per l’applicazione di queste tecnologie anche ad altri difetti genetici che causano malattie rare.

Terzo premio (500,00 Euro): dott.ssa Annalisa Schirizzi (Università degli Studi di Bari Aldo Moro) con la tesi: “Analisi trascrittomica di fibroblasti dermici di pazienti affetti da sindrome cardiospondilocarpofacciale".

La sindrome Cardiospondilocarpofacciale (CSCFS) è una patologia rara del tessuto connettivo, descritta per la prima volta nel 2016 dal gruppo di LeGoff. Questa sindrome prende il nome dalle principali caratteristiche fenotipiche dei pazienti che ne sono affetti, tutti accomunati da ritardo nella crescita, dismorfismi facciali, brachidattilia con fusione carpo-tarsale, ipermobilità articolare, fusione delle vertebre cervicali e difetti del setto cardiaco con displasia valvolare.

L’obiettivo della mia tesi è stato analizzare nuove varianti in eterozigosi a livello di MAP3K7 (che codifica per TAK1) e TAB2, due geni appartenenti alla stessa pathway biologica, trovate in pazienti che mostravano caratteristiche tipiche della CSCFS.

Per prima cosa ho dimostrato l’effetto patogenico della nuova variante c.737-7A>G nel gene MAP3K7. Il trascritto derivante dal gene mutato codifica per una proteina che ha due amminoacidi in più nel dominio chinasico, che si sovrappone parzialmente al dominio di legame con la proteina TAB1. Questo comporta una minore stabilità della proteina nei pazienti e l’inibizione della formazione del complesso TAK1-TAB1, fondamentale per l’attivazione di processi molecolari a valle. Fra questi processi, molto importante è l’attivazione di geni che controllano la sintesi di proteine che fanno parte della matrice extracellulare (ECM), componente principale del tessuto connettivo. Attraverso esperimenti di immunofluorescenza ho dimostrato infatti che nelle cellule dei pazienti non si ha la sintesi di fibre di fibrillina, componente essenziale delle fibre elastiche del tessuto connettivo, ciò determina una disorganizzazione dell’ECM, le cui proteine non formano un reticolo ben definito a differenza di ciò che avviene nelle cellule dei controlli sani. Questo comporta a livello dei pazienti la formazione di un tessuto connettivo iperlasso.

Inoltre, ho dimostrato la patogenicità di sei nuove varianti trovate a livello del gene TAB2 in altri dodici pazienti giunti in consulenza genica presso l’ospedale Casa Sollievo della Sofferenza (FG). Attraverso analisi funzionali ho dimostrato che tutte queste varianti in TAB2 causano la sintesi di proteine mutate che hanno una minore attività chinasica, questo si traduce in una minore attivazione dei geni a valle di questa cascata molecolare.

Infine, per meglio comprendere le basi molecolari di questa patologia rara è stata effettuata l’analisi dell’intero trascrittoma dei fibroblasti di tre pazienti e tre controlli sani e con il supporto dell’unità di Bioinformatica sono stati individuati ben 200 geni differenzialmente espressi nei pazienti rispetto ai controlli sani. Questi geni up-regolati o down-regolati nei pazienti sono coinvolti in diverse pathways biologiche ma quelle che ho ritenuto più interessanti sono state la pathway cardiaca e quella neuronale, maggiormente rappresentate nel fenotipo di questi pazienti.

Questo lavoro ha contribuito alla comprensione della patogenesi molecolare associata a questa condizione fenotipica e apre la strada alla possibilità di nuove terapie molecolari per il trattamento di questo disordine. Diversi studi riportano l’angiotensina II come uno stimolatore dell’attivazione endogena del segnale di TAK1 in fibroblasti atriali e cardiomiociti. Ulteriori analisi in vitro saranno necessarie per valutare l’efficienza di questa molecola nel ristabilire il segnale del TGFβ e di conseguenza migliorare diversi aspetti clinici dei pazienti che hanno patologie che coinvolgono questa pathway.


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